А.Н. Берестяная
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины;
ГУ «Институт геронтологии имени Д.Ф. Чеботарёва НАМН Украины», Киев
Процесс старения обусловлен комплексным взаимодействием генетического аппарата и повреждающих факторов различной природы. Эпигеном, как динамическая система контроля экспрессии генов, выступает связующим звеном в данном взаимодействии. Выяснение эпигенетической компоненты в механизмах регуляции старения и установление воздействия на эти процессы радиационного облучения является на сегодняшний день одним из актуальных вопросов биологии. Целью работы было исследование изменений эпигенома в ходе онтогенеза Linum usitatissimum, подверженного действию разных доз однократного рентгеновского облучения.
Материалы и методы. Семена Linum usitatissimum подвергались воздействию однократного рентгеновского облучения в 4 дозах: 10 Гр, 20 Гр, 50 Гр, 100 Гр. Растения выращивали в условиях вегетационного опыта. Объектом исследования была ДНК семядольных листьев. ДНК выделяли модифицированным СТАБ-методом. Исследовали эпигеном путем метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Каждый из образцов ДНК в количестве 1 мкг подвергали гидролизу в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ед. акт. метилчувствительной рестиктазы HpaII в реакционном буфере, при температуре 37 оС в течение 2 ч. Использовали 1 мкл реакционной смеси для последующей амплификации с соответствующими праймерами.
Результаты и обсуждение. Метод МЧ-ПЦР позволяет определять статус метилирования в динамике и прослеживать характер его изменения. В данной работе с помощью метода МЧ-ПЦР мы провели полногеномный анализ статуса метилирования CG-сайтов, а также скрининг метилирования в регуляторном участке гена 5S рРНК Linum usitatissimum. Учитывая, что задачей исследования было определение эпигенетических изменений в образцах, облученных дозами ионизирующего излучения в ходе онтогенеза, мы строили исследование таким образом, чтобы фиксировать параметры на разных стадиях онтогенеза семядольных листьев, условно обозначенных как: С1, С2, С3, С4, каждая из которых соответствует этапам морфологически и биохимически значимых изменений тканей.
В результате скрининга CG-сайтов в геноме и фрагменте гена 5S рРНК, мы установили наличие дозовой зависимости. С увеличением дозы облучения возникали дополнительные продукты реакции, что указывало на появление новых сайтов метилирования в облученных образцах. Именно эти продукты ПЦР и представляли главный предмет наших поисков. Предположительно, это эпигенетические маркеры однократного рентгеновского облучения, которое провоцирует дополнительное метилирование как реакцию защиты генов. В процессе старения листьев Linum usitatissimum наблюдалось снижение уровня метилирования CG-динуклеотидов генома, а также уменьшение количества метилированных сайтов во фрагменте гена 5S рРНК в облученных образцах. Та картина дозовой зависимости повышения уровня метилирования, которую мы наблюдали на ранней стадии онтогенеза, нивелируется в процессе перехода к поздним стадиям.
Выводы. Скрининг сайтов метилирования с помощью МЧ-ПЦР показал дозозависимое увеличение метилированных последовательностей на начальных стадиях онтогенеза, и уменьшение метилированных сайтов на поздних этапах онтогенеза, вследствие возрастного гипометилирования генома.